国自然新思路：诱导性肺泡类器官解析肺泡上皮-巨噬细胞对话机制

肺部疾病一直是全球健康的重大威胁之一，其复杂性使得研究和治疗面临诸多挑战。近日，一项发表在《Nature Communications》杂志上的最新研究为我们带来了新的希望。

研究人员成功开发了一种名为“诱导性肺泡类器官集合体”（iAlvAssemb）的体外模型，通过将人类多能干细胞衍生的肺泡上皮类器官与诱导性巨噬细胞共培养，模拟出与人体肺部相似的微环境，为研究肺部发育、免疫反应及疾病机制提供了一个全新的平台。

文章介绍

题目：含有功能性肺泡样巨噬细胞的诱导性肺泡类器官集合体的生成

杂志：Nature Communications

影响因子：IF=14.7

发表时间：2025年4月

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研究背景

Background

肺部疾病是全球范围内的主要健康问题之一，其发病机制复杂，涉及多种细胞类型之间的相互作用。肺泡上皮细胞与肺泡巨噬细胞之间的交互作用在肺部的正常生理功能、免疫反应以及疾病发生中起着关键作用。然而，由于缺乏合适的体外模型，这些细胞间相互作用的详细机制尚未完全明确。

传统的细胞培养方法无法完全模拟肺部的复杂微环境，而动物模型又存在种属差异和伦理问题。近年来，类器官技术的发展为研究肺部疾病提供了新的可能性。

类器官能够模拟组织的三维结构和功能，为研究细胞间的相互作用提供了更为接近生理状态的平台。因此，开发一种能够模拟肺泡上皮细胞与巨噬细胞相互作用的类器官模型，对于深入理解肺部疾病的发病机制具有重要意义。

#2

研究思路

Methods

本研究旨在开发一种能够模拟肺泡上皮细胞与巨噬细胞相互作用的类器官模型。首先利用人类多能干细胞（hPSC）分化生成肺泡上皮类器官（iAEO）和诱导性巨噬细胞（iMφ）。

通过优化培养条件，将这两种细胞类型共培养，构建出诱导性肺泡类器官集合体（iAlvAssemb）。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和功能分析，研究肺泡上皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用及其在组织稳态和疾病中的作用。

此外，通过模拟肺泡上皮损伤和感染，评估iAlvAssemb在模拟疾病状态下的功能响应。最后通过基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）和细胞因子处理，探索调控巨噬细胞组织适应性的关键因素。

通过这些研究，揭示肺泡上皮细胞与巨噬细胞之间的交互作用机制，并为肺部疾病的治疗提供新的策略。

#3

研究结果

Results

1、iAEO与iMφ共培养生成iAlvAssemb

为了开发包含功能性巨噬细胞的iAlvAssemb，首先从hPSC系中生成iAEO和iMφ。对于iAEO的分化，采用逐步分化法，并通过流式细胞仪分析验证分化效率。

iAEO通过溶酶体追踪剂染色（图1a）、iAEO特异性标记物的免疫染色（图1b-c）以及透射电子显微镜（TEM）成像（图1d）进行表征。验证了iMφ表达巨噬细胞特异性细胞表面标记物（图1e-f），并激活了与巨噬细胞相关的基因的转录（图1g）。

随后，确定一种能够维持每种细胞类型特性的细胞培养基。当评估iAEO在iMφ培养基中培养是否能够保持活性和增殖能力时，发现iAEO无法存活。而将iMφ培养在iAEO培养基中时，iMφ生长受到抑制且失去了其特征性的细胞表面表型。

通过仔细评估每种培养基中的培养补充剂，成功识别了每种细胞类型的关键和有害因素。基于这些发现，开发了一种基于RPMI的共培养基，命名为KSFM，该培养基补充了FGF7、SB431542、FBS和M-CSF，并能够维持iAEO和iMφ的特性。KSFM是一种仅在iMφ培养基中添加低浓度SB431542和KGF的培养基。它可以维持与iMφ特异性培养基相似的功能。在共培养中，iAEO和iMφ的比例保持在3:1以下，因为更高的iMφ比例会导致IL1β水平升高，可能形成类似于炎症反应的环境。

在iAlvAssemb系统中，观察到肺泡iMφ（Alv-iMφ）围绕肺泡iAEO（Alv-iAEO）聚集（图1h-k）。免疫染色证实了细胞类型特异性标记物，验证了Alv-iMφ和Alv-iAEO在iAlvAssemb系统中的细胞特性保持一致（图1k）。在iAlvAssemb中检测到趋化因子以及细胞因子的分泌增加（图1l–o），这表明巨噬细胞在肺泡iAEO微环境中发生了功能成熟，为iAlvAssemb提供了一个动态且具有交互性的细胞环境。这些发现证明了iAlvAssemb模型的成功建立。

图1

2、iAlvAssemb中，Alv-iAEO与Alv-iMφ之间的交互性通讯

利用scRNA-seq分析研究iAlvAssemb中Alv-iAEO与Alv-iMφ之间的相互作用。采用无监督降维方法对细胞进行分组，随后利用每种细胞类型的代表性标记物进行注释（图2a-d）。

结果显示，iMφ形成一个单一的细胞簇，而iAEO群体则由三个不同的簇组成：肺泡上皮细胞（AEC）、增殖性肺泡上皮细胞、肺神经内分泌细胞（图2a-d）。其中，AEC包括肺泡Ⅱ型样细胞（AT2-like）和肺泡Ⅰ型样细胞（AT1-like）。在iAlvAssemb中，Alv-iAEC和Alv-iMφ形成了与原始细胞不同的簇，表明这些细胞在共培养后发生了差异性基因表达（图2a-b）。

差异表达基因（DEG）分析展示了巨噬细胞和肺泡上皮细胞中的基因表达变化，巨噬细胞中观察到的差异表达基因数量更多（图2e-f），表明细胞间存在动态的相互作用。

通过Reactome通路分析发现，与巨噬细胞功能相关的基因表达增加。还观察到与肺泡表面活性物质代谢相关的基因表达上调（图2f-g）。在iAlvAssemb培养中，人类肺泡巨噬细胞（AM）富集基因表达上调（图2h-i），表明在iAlvAssemb中细胞获得了类似AM的表型。

通过流式细胞仪分析确认了表面标记物CD14、CD16和CD163的表达增加（图2j-k），通过免疫细胞化学验证了肺泡巨噬细胞特异性标记物的表达上调（图2l）。这些数据表明，在iAlvAssemb培养中，Alv-iMφ获得了类似AM的状态。

图2

3、Alv-iMφ在Alv-iAEO微环境中表现类似AM的组织适应性

为了探究类似AM适应性的分子基础，对对照组诱导性巨噬细胞（ctrl-iMφ）以及从iAlvAssemb中分离出的Alv-iMφ进行了全转录组测序（图3a-b）。基因集富集分析（GSEA）显示，与ctrl-iMφ相比，Alv-iMφ中富集了肺巨噬细胞的基因特征（图3c）。

为了研究Alv-iMφ的成熟过程，比较了Alv-iMφ、Ctrl-iMφ、单核来源巨噬细胞（mono-Mφ）以及从支气管肺泡灌洗液中分离的人肺泡巨噬细胞（HBAM）的基因表达变化（图3d）。

结果显示，Alv-iMφ与HBAM之间具有最高的相关性，表明Alv-iMφ在基因表达上与HBAM高度相似（图3d）。样本距离矩阵分析也显示，Alv-iMφ与HBAM在基因表达谱上最为接近，进一步支持了Alv-iMφ经历了类似AM的成熟过程（图3e）。

为了评估Alv-iMφ的肺部特异性适应性，将其与先前报道的小鼠肺部RNA测序数据（GSE63340）进行比较，并在多种组织驻留巨噬细胞中鉴定出460个AM富集基因。通过分析这些基因的人类同源基因的表达，进一步确定了180个在Alv-iMφ中上调的基因（图3f）。

通过RT-PCR验证，发现IL1B、IL8、MSR1、ALOX5和GPNMB基因的表达显著增加（图3g）。Alv-iMφ中肺泡表面活性物质相关基因的mRNA水平显著增加，而mono-Mφ或Ctrl-iMφ中并未出现这种现象（图3f），这与人类肺组织的scRNA-seq数据一致。

为评估Alv-iMφ的功能特性，检测了ctrl-iMφ和Alv-iMφ的吞噬作用和脂质摄取能力。确认两组细胞中超过80%的细胞均表现出吞噬作用，且Alv-iMφ的脂质摄取能力显著增强（图3h–i），表明其功能得到了显著改善。

图3

4、Alv-iMφ对肺泡损伤的功能性响应

AM具有高度特征性的细长伪足，这些伪足能够伸入肺泡腔，从而与吸入的颗粒和微生物相互作用。观察到Alv-iMφ能够形成类似伪足的结构，并且其吞噬体中含有板层小体，表明其具有功能性吞噬作用以及肺泡表面活性物质脂质的回收功能（图4a）。

为了评估AlvAssemb平台是否能够复现体内细胞功能，采用博莱霉素诱导肺泡上皮损伤。经过48小时处理后，损伤应答基因在Ctrl-iAEO、Ctrl-iMφ以及iAlvAssemb中表达上调（图4b）。

通过活/死细胞染色和裂解型Caspase 3的免疫染色，发现iAlvAssemb中的死亡细胞数量显著少于仅含有Ctrl-iAEO的样本（图4c），表明Alv-iMφ在iAlvAssemb中有效地清除了受损的肺泡细胞，这是AM在组织稳态中的一项关键体内功能。

为了验证这一能力，对氧化脂质进行了染色，因为已知肺泡巨噬细胞能够摄取来自死亡细胞的氧化脂质。数据显示，在Ctrl-iAEO中受损的AEC中存在氧化脂质，但在Alv-iMφ中并未检测到。相比之下，iAlvAssemb中的Alv-iMφ显示出氧化脂质信号，表明在吞噬清除受损细胞碎片的过程中，Alv-iMφ摄取了氧化脂质（图4d）。

这些发现表明，Alv-iMφ在结构和功能上均已成熟，而iAlvAssemb是一个有前景的细胞平台，可用于研究体内已知发生的人类细胞间功能相互作用。

图4

5、GM-CSF：一种促进Alv-iMφ组织适应性的旁分泌因子

为了探究在iAlvAssemb中iMφ组织适应性的相关因素，建立了一个共生类器官共培养系统，其中iAEO和iMφ共享同一培养基，但在同一个培养皿内分别置于独立的Matrigel穹顶中（图5a）。在这种设置中，检测到与Alv-iMφ相关的基因在共生诱导性巨噬细胞（para-iMφ）中表达上调，表明iAEO分泌的旁分泌因子能够调节iMφ的组织适应性（图5b）。

通过scRNA-seq，在SFTPC阳性的AT2中检测到GM-CSF的高表达（图5c）。利用细胞因子芯片分析，证实GM-CSF在iAEO和iAlvAssemb中均有分泌，通过RT-PCR验证GM-CSF受体（CSF2RA）在Ctrl-iMφ和iAlvAssemb中均有表达（图5d-e）。

当用GM-CSF（而非G-CSF）处理Ctrl-iMφ时，发现与Alv-iMφ相关的基因表达增加（图5f-g）。免疫染色进一步证实了AM特异性标记物MSR1的表达增加，以及GM-CSF处理后脂质摄取能力的增强（图5h-i）。应用GM-CSF阻断抗体，部分抑制了iAlvAssemb中Alv-iMφ相关基因的上调。

图5

为明确GM-CSF在Alv-iMφ适应性中的作用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了GM-CSF基因敲除（CSF2-/-）的iAEO（图6a–d），并利用ELISA验证了GM-CSF分泌的缺失（图5l）。

当iMφ与CSF2-/-的iAEO共培养时，与iAEO相互作用而上调的基因并未出现表达增加（图6f-g）。此外，与CSF2-/-的iAEO共培养的Alv-iMφ的脂质摄取能力也显著降低（图6h-i），表明GM-CSF在iAlvAssemb中Alv-iMφ的组织适应性中发挥重要作用。

图6

6、白细胞介素介导的AEC中表面活性物质的调控

在iAlvAssemb的t-SNE图中，观察到一个独特的AEC簇，这反映了与Alv-iMφ相互作用后显著的基因表达变化（图7a）。还检测到与表面活性物质代谢相关的基因表达增加（图7b–d），而AT1的标记物表达并未发生变化（图7e）。

通过RT-PCR验证了这些基因表达的变化（图7f），并且在间接共生类器官培养中也观察到类似的基因表达增加（图7g-h），这表明旁分泌信号指导了这些基因表达的变化。

值得注意的是，IL-1β和IL-6处理能够以浓度依赖的方式上调SFTPA1和SFTPA2的表达（图7i）。相反，在较高浓度下，IL-1β和IL-6抑制了SFTPC的表达。从IL1B基因敲除（IL1B-/-）或IL6基因敲除（IL6-/-）的人胚胎干细胞（hESC）分化的iMφ表现出IL-6分泌增加的IL1B-/- iMφ，这可能是由于这些细胞因子之间的功能补偿所致。

在与缺乏IL-6但IL-1β水平增加的IL6-/- iMφ共培养中，表面活性物质相关基因SFTPA1和SFTPC的表达显著增加，同时IL1R1和SLC34A2的表达减少。相反，与IL1B-/- iMφ共培养则导致IL1R1和SLC34A2的表达增加，这表明IL-6特异性地影响IL1R1和SLC34A2的表达，而IL-1β和IL-6均对表面活性物质相关基因表达产生影响。

图7

7、iAlvAssemb对脂多糖（LPS）及结核分枝杆菌（M. tb）感染的响应

为了评估iAlvAssemb模拟由肺部感染引起的免疫反应的能力，在LPS刺激后进行单细胞RNA测序分析。在t-SNE分析中，注意到经LPS处理与未经处理的iAlvAssemb中的巨噬细胞和IL1R1阳性AEC呈现出明显的聚类差异（图8a–f）。

在DEG中，发现AEC和Mφ中共有37个共同的变化，表明在抗原呈递、内质网-吞噬体途径和干扰素信号传导方面存在共享的改变（图8g-i）。一些细胞因子、趋化因子和表面分子仅在Alv-iMφ中上调（图8j-l），而在AEC中，IL32的表达发生改变，且肺泡Ⅰ型细胞标记物的表达降低（图8m）。

值得注意的是，与AEC相比，Alv-iMφ中核糖体蛋白和翻译相关基因的表达显著下降（图8i），这表明感染可能对细胞类型特异性的翻译过程存在差异性调控。这些发现支持iAlvAssemb可以作为一种与人类疾病相关的模型系统，用于研究炎症和呼吸道传染病，为肺微环境趋向性和感染动态提供了见解。

图8

小结

该研究通过构建诱导性肺泡类器官，不仅成功模拟了肺泡上皮细胞与巨噬细胞之间的动态交互作用，还揭示了这些细胞在肺部免疫防御、组织修复及疾病发生中的重要作用。特别是发现GM-CSF等因子对巨噬细胞功能的调控，为理解肺部免疫机制提供了新的视角。

这一成果不仅为肺部疾病的基础研究提供了有力工具，也为开发针对肺部疾病的新型治疗策略提供了重要依据，有望为改善肺部疾病患者的预后带来新的希望。

参考文献

Kang JS, Lee Y, Lee Y, Gil D, Kim MJ, Wood C, Delorme V, Lee JM, Ko KC, Kim JH, Lee MO. Generation of induced alveolar assembloids with functional alveolar-like macrophages. Nat Commun. 2025 Apr 9;16(1):3346. doi: 10.1038/s41467-025-58450-w.