Nat Protoc发布人内耳类器官标准化培养流程，助力发育研究

2025年6月，来自美国哈佛大学波士顿儿童医院的Karl R Koehler和Jiyoon Lee团队在Nature Protocols（中科院2区，IF=16）上发表了题为《Generation and characterization of vestibular inner ear organoids from human pluripotent stem cells》的文章。

该论文介绍了一种构建内耳类器官（IEO）的分步方法并利用这些类器官阐明了控制其发育轨迹的信号。

#1

摘要

Abstract

内耳在听觉和平衡感知中起着关键作用。尽管全球许多人受到听力损失和眩晕等问题困扰，目前的治疗方法主要依赖助听器等技术设备。近年来，基因治疗在治疗遗传性听力损失方面取得突破，突显出开发可扩展研究平台的重要性，以更深入了解各种内耳疾病。

虽然动物模型在研究听力和平衡障碍方面有效，但体外的人类内耳模型也显示出在疾病研究和发育生物学方面的巨大潜力。已有研究表明，通过模拟胎儿期内耳的发育环境，可以引导干细胞分化为耳部前体细胞。

本文介绍了一种IEO培养方案，从人类多能干细胞（hPS细胞）稳定生成包含前庭毛细胞的感觉上皮。

本方法是在此前皮肤类器官培养方案的基础上优化而来，目标是帮助更多研究人员掌握IEO技术，进一步推动治疗听力和平衡障碍的新疗法开发。

#2

研究思路

Methods

第一阶段：类器官分化与培养

多能干细胞的复苏与扩增

IEO的诱导分化

基质胶包埋与培养优化

第二阶段：类器官的形态学与结构观察

光学显微镜观察发育过程

活体和固定类器官的切片制备

第三阶段：免疫荧光染色与分子标志物分析

免疫染色与特异性标志物检测

共聚焦显微镜成像

下图是IEO重现胚胎内耳的发育过程

图1

实验设计

下图是实验方案的示意图

图2

一. 试剂准备

1. 核心细胞培养试剂：

2. 不同分化阶段及成熟期所需的基础培养基

3. 诱导IEO的专用分化培养基OMM

二. 实验步骤

▲ hPSC培养（包括hESC和hPSC）的某些特点与生成含毛囊的SKO和IEO的方案相同。之前针对SKO的方案详细描述了PSC的解冻、维持、传代和冷冻的具体步骤。

▲ 每个步骤均在组织培养生物安全柜中进行，并使用适当的生物安全2级个人防护设备。

▲ 务必将培养基在室温（RT，~20°C）下预热15-20分钟。请勿在水浴或37°C下加热培养基。

分化第（-2）天：细胞解离与重聚

● 时间：约50分钟

▲本方案基于标准的两块96孔板的培养方法，使用75–80%汇合度的细胞。

培养基与酶的准备

1. 准备两个锥形管，分别加入10 mL和22 mL的E8 Flex培养基。

在10 mL中加入10 μL Y-27632（终浓度10 μM，简称E8+10Y）。

在22 mL中加入44 μL Y-27632（终浓度20 μM，简称E8+20Y）。

将培养基静置于室温平衡。

2. 在室温下或37°C预热Accutase。

▲ 建议使用37°C预热的Accutase，能有效缩短消化时间，提高解离效率。

细胞解离

3. 吸去六孔板中一个孔的废培养基。

4. 用2 mL 1×DPBS轻柔冲洗两次，吸尽最后一次DPBS。

5. 加入500 μL预热的Accutase，放入37°C培养箱（5%CO₂）孵育3–4分钟。孵育2–3分钟后，轻轻晃动培养板，辅助细胞脱落。在显微镜下检查，如果细胞仍有附着，继续每次递增20秒，直到细胞松散，大部分变成单细胞。

6. 用p1000带Wide-O吸头，顺时针与逆时针在孔内轻柔吹打，将脱落的细胞汇集到孔底。

7. 继续倾斜培养板，在孔顶部加入1 mL E8+10Y，让剩余细胞流向孔底。用适度的力度再次吹打，帮助松散细胞解离。

8. 将孔底的细胞悬液转移至15 mL锥形管中。

9. 重复步骤7–8，再次用1 mL E8+10Y清洗，确保细胞充分回收。最终细胞悬液体积约为2.5 mL。

10. 在锥形管中，用p1000枪头轻柔上下吹打，进一步打散残留的细胞团。

11. 使用5 mL移液管，加入额外的3 mL E8+10Y，使总悬液体积达到约5.5 mL。

12. 在室温下，230g离心5分30秒，让细胞沉淀。

13. 轻轻倾斜试管，去除上清液。

▲ 注意不要误吸细胞沉淀。

14. 使用p1000 Wide-O枪头，将细胞重悬于1 mL E8+10Y中，通过轻柔上下吹打使细胞分散。

细胞聚集、细胞过滤

15. 先对35 μm细胞过滤器进行预平衡：使用p1000普通吸头，以稳定的力度缓慢吸取1 mL E8+10Y培养基，通过过滤网缓慢挤入下方管中。

16. 将步骤14中重悬于1 mL E8+10Y中的细胞缓慢滴加到预平衡好的过滤器中。

17. 为确保尽可能多地回收细胞，用1 mL E8+10Y冲洗含细胞的锥形管，将洗液同样缓慢滴加到过滤器中。此时过滤器下方的管内总液体体积约为3 mL。

18. 轻轻敲击过滤器管体，使卡在过滤网下方的液滴全部落入管底。

19. 小心取下并丢弃带有过滤网的快扣盖。

细胞计数

20. 使用如下方法计算活细胞数：在一个500 μL离心管中加入50 μL台盼蓝染液。用p1000带Wide-O吸头充分吹打混匀步骤18中管内的细胞悬液。立即用p200普通吸头，从混匀后的悬液中心取50 μL，加入到50 μL台盼蓝中，形成1:1的稀释。轻柔吹打充分混匀。将混合液的11 μL分别加载到Countess III自动细胞计数板的两侧，或加载到血球计数板（Hemocytometer）上。记录Countess III显示的每毫升活细胞数。

▲ 注意：Countess III会自动考虑台盼蓝的稀释倍数。如果手动计数，需将计数结果乘以2以修正稀释。分化培养的目标浓度是 35,000个细胞/mL（即每孔100 μL含3,500个细胞）。若培养两块96孔板，总需 22 mL 的细胞悬液，含7.7×10⁵个细胞。举例计算：若Countess III计得活细胞浓度为5×10⁵个/mL，则所需细胞悬液体积V₁为：C₁V₁ = C₂V₂(5×10⁵) × V₁ = (0.35×10⁵) × 22V₁ = 1.54 mL

配制细胞悬液

21. 根据计算结果，从22 mL的E8+20Y中去除与细胞悬液相等的体积（V₁ mL），然后加入V₁ mL的细胞悬液。例如：若需要1.54 mL细胞悬液，则先移除1.54 mL的E8+20Y，再加入1.54 mL细胞悬液，最终体积仍为22 mL，细胞浓度为7.7×10⁵个/22 mL。在移取细胞悬液前，务必充分吹打混匀过滤器管内的悬液，以保证细胞分布均匀，计数准确。

22. 轻轻反复倒置或旋涡震荡混匀细胞悬液。

23. 将22 mL细胞悬液倒入25 mL的移液槽中。

24. 使用多道移液器（配p200普通吸头），在96孔U型低附着力培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液。

▲ 注意：移液时避免吸头刮伤孔壁，以防影响细胞聚集。

25. 以110 g在室温下离心培养板6分钟，帮助细胞聚集。

26. 将培养板放入37°C、5% CO₂培养箱中孵育24小时。

分化第（-1）天：：Y 因子稀释过渡

时间：15 分钟

27. 取22 mL新鲜E8 Flex培养基（含100 μg/mL Normocin，但不含Y，以下简称E8），在室温预平衡。

28. 将22 mL的E8倒入25 mL的移液槽中。

29. 使用多道移液器（配p200普通吸头），在每个孔中加入100 μL的E8，使每孔总液体体积达到200 μL。

▲ 关键：缓慢加入，避免破坏脆弱的多能性细胞聚集体，并防止刮伤孔内的抗粘附涂层。

30. 将培养板放入37°C、5% CO₂培养箱孵育24小时。

31. 为第二天使用，提前在冰上解冻650 μL Matrigel，并在4°C过夜保存。

分化日（0）：开始分化——转换至E6培养基，通过SB、BMP4和低浓度bFGF诱导形成表面外胚层

时间：1小时30分钟

▲ 关键：本步骤全程在冰上进行。

▲ 注意：以下配方基于BMP4浓度为1.25 ng/mL。如果用于大规模分化或BMP梯度实验，应根据具体需求调整BMP4浓度。

32. 制备含有2% Matrigel、10 μM SB、4 ng/mL bFGF、1.25 ng/mL BMP4和100 μg/mL Normocin的E6培养基，以下简称E6SFB。具体配制步骤：在50 mL锥形管中加入30 mL冰冷的E6培养基。从中取出600 μL E6，加入600 μL Matrigel，使终浓度为2% Matrigel。

▲ 务必先进行Matrigel的添加，以保证后续分子浓度准确。然后加入30 μL的10 mM SB、0.6 μL的200 μg/mL bFGF、3.75 μL的10 μg/mL BMP4（通过将100 μg/mL的BMP4原液以1:10稀释制备）、60 μL的50 mg/mL Normocin。BMP4 稀释方法：将2 μL的100 μg/mL BMP4 加入18 μL E6中，充分吹打混匀，得到 10 μg/mL的工作液。将混合好的E6SFB管反复轻轻倒置混匀，始终保持在冰上。▲ BMP4的最佳浓度因细胞系而异。例如：对于WA25细胞系，0.5 ng/mL即可；而大多数hiPSC细胞系推荐使用 0.75–2.00 ng/mL。建议每次更换细胞系前进行BMP4梯度优化。

33. 准备3 mL冰冷的E6培养基，用于清洗步骤。

34. 从96孔U底低附着力培养板中，将细胞聚集体转移至2 mL圆底离心管，步骤如下：使用多道移液器（配 p200 Wide-O 吸头，设定体积为 170 μL，即每孔少于总容量约30 μL）轻柔地吸取每孔的细胞聚集体，转移到一个100 mm培养皿中。

▲ 移液时需小心，避免破坏聚集体结构。轻轻晃动培养皿，将所有聚集体汇集至中央。使用p1000 Wide-O吸头，将聚集体全部转移至2 mL圆底离心管。

35. 待聚集体沉降到管底后，小心去除上清E8培养基。

36. 用步骤33中准备的 E6 培养基进行3次清洗，每次加入1 mL，彻底去除残留的E8 成分。

37. 最后一次清洗后，加入1 mL的E6SFB，将聚集体重新悬浮。

38. 在冰上准备一个新的100 mm培养皿，加入约15 mL的E6SFB。

39. 使用p1000 Wide-O 吸头，将步骤37中含有细胞聚集体的 1 mL E6SFB一同转移至培养皿中。

40. 再用1 mL E6SFB冲洗2 mL离心管，确保细胞完全转移，冲洗液也倒入培养皿中。

41. 使用p200 Wide-O吸头，从培养皿中取100 μL的细胞悬液（含一个聚集体），分别分装至新的 96孔U底低附着力培养板的每一个孔中。根据需要，随时向培养皿中补充E6SFB。

42. 将培养板放入37°C、5% CO₂培养箱中孵育72小时。

43. 每天观察细胞形态的变化。

分化第3天：通过LDN和bFGF进行耳前板诱导

时间：20分钟

▲ 关键：本次处理采用每孔25 μL的LDN和FGF工作液，加入到已有的100 μL培养液中，使每孔的总容量为125 μL。因此，LDN和FGF按5×浓度配制：LDN：1 μM（最终200 nM），bFGF：250 ng/mL（最终50 ng/mL）括号内为加入后在125 μL终体积中的最终浓度。

44. 配制 E6-5XLF（E6 + 100 μg/mL Normocin + 1 μM LDN + 250 ng/mL bFGF）：在 15 mL 锥形管中加入 5 mL E6 培养基，室温预热。加入：10 μL 的 50 mg/mL Normocin、0.5 μL 的 10 mM LDN、6.25 μL 的 200 μg/mL bFGF轻轻倒置混匀。

45. 将5 mL的E6-5XLF倒入一个10 mL的移液槽中。

46. 使用多道移液器，每个孔中加入25 μL E6-5XLF，分装至96孔U底低附着力板的内侧60个孔。

▲ 注意：避免使用边缘孔，因其中溶液容易蒸发，影响实验一致性。

47. 在生物安全柜中，轻轻敲击培养板底部，帮助液体充分混匀。

48. 将培养板放入37°C、5% CO₂培养箱中孵育72小时。

49. 每日观察细胞形态变化。

分化第6天：营养补充

时间：15 分钟

50. 配制含Normocin的E6培养基：在15 mL锥形管中加入11 mL E6培养基，室温预热。加入22 μL的50 mg/mL Normocin。轻轻倒置混匀。

51. 将11 mL的培养基倒入一个10 mL移液槽中。

52. 使用多道移液器，每个孔加入75 μL的新鲜E6培养基，使每孔最终体积达到200 μL。

53. 在生物安全柜中轻敲培养板底部，混匀。

54. 将培养板放入37°C、5% CO₂培养箱中孵育48小时。

55. 每日观察细胞形态变化。

分化第8天：通过CHIR99021进行耳泡诱导

时间：30 分钟

▲ 关键：每孔去除100 μL旧培养基，保留100 μL。然后加入100 μL含CHIR的新培养基，使最终体积恢复至200 μL，并使CHIR的最终浓度为3 μM。因此，制备的CHIR工作液浓度为6 μM（即2×浓度）。

56. 配制E6-2XCH（E6 + 100 μg/mL Normocin + 6 μM CHIR）：在50 mL锥形管中加入15 mL E6培养基，室温预热。加入：30 μL 的50 mg/mL Normocin、9 μL的10 mM CHIR99021，轻轻倒置混匀。

57. 使用多道移液器（配p200 Wide-O 吸头），以约60°的角度缓慢吸去每孔中100 μL的旧培养基，保留细胞聚集体及剩下的100 μL液体。

▲ 操作时动作要轻柔，避免损伤细胞聚集体或破坏孔内的抗粘附涂层。

58. 将第56步配制好的15 mL E6-2XCH 倒入25 mL的移液槽中。

59. 使用多道移液器（配p200普通吸头），每孔加入100 μL新鲜的E6-2XCH，使最终体积恢复至200 μL，CHIR的最终浓度为3 μM。

60. 在生物安全柜中轻轻敲击培养板底部，使培养基混匀。

61. 将培养板放入37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育48小时。

62. 每日观察细胞形态变化。

分化第10天：持续耳泡诱导

时间：30分钟

63. 制备含100 μg/mL Normocin和3 μM CHIR的E6培养基（简称E6-1XCH）：在 50 mL 锥形管中加入15 mL E6培养基，室温预热。加入：30 μL的50 mg/mL Normocin4.5 μL的10 mM CHIR99021，倒置混匀。

64. 使用p200 Wide-O 吸头，将多道移液器调至100 μL，以约60°角度小心地从每孔中去除100 μL 的旧培养基，保留细胞团及剩余100 μL的液体。

▲ 轻柔操作，避免扰动细胞团或损坏孔内抗附着涂层。

65. 将第63步配制的E6-1XCH倒入25 mL的移液槽中。

66. 每孔加入100 μL 新鲜的E6-1XCH。

67. 在生物安全柜内轻敲培养板底部，帮助混匀。

68. 放入37°C，5% CO₂培养箱中，孵育48小时。

69. 每日观察形态变化。

70. 第11天，在4°C 冰上解冻650 μL Matrigel过夜。

分化第12天：转入浮游培养继续耳泡诱导

时间：1小时30分钟

▲ 关键：从两个96孔U底低附着板的 60个孔（共120个细胞团）转移，可分装到5个24孔低附着培养板。以下培养基体积根据此数量计算，若不同需相应调整。

71. 制备65 mL OMM1%M-CH：在冰上准备 65 mL OMM（参见Table 5）。取出650 μL OMM，加入650 μL Matrigel，使最终浓度为1% Matrigel。

▲ 始终先加入Matrigel，再加入CHIR，确保CHIR浓度准确。再加入19.5 μL的10 mM CHIR99021。轻轻倒置混匀，保持在冰上。

72. 在冰上准备一个100 mm培养皿，备用。

聚集体转移

73. 收集细胞团：用多道移液器（p200 Wide-O 吸头，设定170 μL，比孔内总体积少30 μL），将所有细胞团转移到室温的100 mm培养皿中。

▲ 关键：轻柔操作，避免破坏细胞团完整性。轻轻晃动培养皿，使细胞团聚集在中间。使用 p1000 Wide-O 吸头将细胞团转移至2 mL 圆底管中。

74. 待细胞团沉淀后，小心去除多余培养基。

75. 使用1 mL Advanced DMEM/F12洗涤细胞团3次。

76. 最后一次洗涤后，加入1 mL OMM1%M-CH（第71步），将管子放置在冰上。

转移至24孔板

77. 将约15 mL OMM1%M-CH倒入预先冷却好的100 mm培养皿中（第72步）。

78. 用p1000 Wide-O吸头，将第76步的细胞团全部转移至含OMM1%M-CH的培养皿中。

79. 再用p1000 Wide-O 吸头，将每个细胞团连同500 μL OMM1%M-CH转入24孔低附着培养板的每一个孔中。根据需要可在培养皿中添加更多的OMM1%M-CH。

80. 轻轻晃动和敲击培养板，确保：每孔表面完全被培养基覆盖细胞团既不贴壁，也不漂浮在液面上。

81. 将24孔板放入培养箱中的水平振荡摇床（65 rpm），于37°C，5% CO₂条件下孵育72小时。

82. 每天观察形态变化。

83. 第14天，在4°C冰上解冻320 μL Matrigel过夜。

分化第15天：半量换液，继续耳泡诱导

时间：30分钟

84. 制备32 mL OMM1%M-CH：在冰上准备32 mL OMM。取出320 μL OMM，加入320 μL Matrigel（最终1%）。

▲ 先加Matrigel，再加CHIR。加入：9.6 μL的10 mM CHIR99021。轻轻倒置混匀，保持冰上。

85. 用p1000 吸头，从每个孔中去除250 μL旧培养基，每孔剩余约250 μL。

86. 每孔加入250 μL新鲜OMM1%M-CH，使最终体积约为500 μL。

87. 立即轻轻晃动混匀。

▲ 确保细胞团完全浸没，不浮在培养基表面。

88. 将培养板放入振荡培养箱（65 rpm），在37°C，5% CO₂条件下孵育72小时。

89. 每3天观察一次形态变化。

分化第18天：稀释 Matrigel（半量换液）

时间：30分钟

90. 预热32 mL不含Matrigel和CHIR的OMM培养基。

91. 每孔去除250 μL 旧培养基，保留约250 μL。

92. 每孔加入250 μL 新鲜OMM，使终体积约500 μL。

93. 轻轻晃动培养板使培养基混匀。

▲ 确认细胞团完全浸没在培养基中94. 将培养板继续放入振荡培养箱（65 rpm），于37°C，5% CO₂下孵育72小时。

分化第21天及以后：长期培养维护

95. 从第21天开始，采用以下换液策略：每周进行一次全量换液（完全去除500 μL，更换新鲜500 μL OMM），若实验持续至第45天以内，则：每周一和周三进行半量换液（去除250 μL，加入250 μL新鲜OMM）；每周五进行全量换液。若实验超过第45天，则改为每隔一天进行一次全量换液。根据类器官的生长情况调整培养基体积至1-1.5 mL/孔，以满足：类器官变大（尺寸增大）；更加致密（颜色变深）；培养基消耗增加（pH变化，变黄）。

下游检测

96. 在指定的时间点，可以对类器官进行解离或按之前报道的方法进行后续分析。具体来说：如果需要进行冷冻包埋、切片和免疫染色，请参考 Lee et al., 2022；如果进行全器官透明化免疫染色，可使用SHIELD方法（选项A）；若需要进行活体组织的振动切片分析，请选择选项B；若需要对固定组织进行振动切片分析，则采用选项C。

▲ 上述方法适用于不同的分化阶段，具体选择取决于研究问题。

▲ 注意： 如果采用选项A或选项C，类器官必须首先进行固定。

固定步骤：

1. 使用Wide-O移液器吸头（或根据需要剪开的移液器吸头）收集类器官。

2. 将类器官从培养皿转移至2 mL圆底EP管中。

3. 吸除上清培养基，用1 mL 1×PBS清洗三次。

4. 第三次吸尽PBS后，加入1 mL 4% PFA，放置于4°C冰箱中固定过夜（约12小时）。

5. 固定结束后，再用1×PBS清洗三次。随后类器官可储存在PBS中，长期保存。

（A）SHIELD全器官透明化免疫染色

时长：8天

▲ 此步骤是在Park et al., 2018和Albanese et al., 2020基础上，针对类器官优化改编的。

▲ 确保类器官已经用4% PFA固定，并储存在1×PBS中。

▲ 提前确认一抗和二抗充足。强烈建议在进行全器官染色前，先在冷冻切片上验证抗体有效性，以免浪费样本。

第1天：SHIELD-OFF处理

时间：15分钟准备+48小时孵育

1. 配制20 mL的12.5% SHIELD-Epoxy-OFF溶液（冰上操作）

取 5 mL SHIELD Buffer加入12.5 mL超纯水，充分涡旋混匀，置于冰上。

加入2.5 mL SHIELD-Epoxy，混匀，总体积为 20 mL。

再次涡旋，混匀均匀。

2. 将类器官转移到2 mL圆底离心管

每管放1-3个类器官（直径约3 mm）。若样品较大或脆弱（如>4.5 mm），每管仅放1个。

使用剪过口的宽口移液枪头（Wide-O tip）或勺子轻柔转移。

小心去除管中残留的溶液。

加入1.5 mL冰冷的12.5% SHIELD-Epoxy-OFF溶液，剩余溶液可4°C保存2周。

▲ 如需保留内源荧光，整个过程需避光。

3. 4°C孵育48小时（可选：轻柔旋转/摇床确保均匀处理）。

第3天：SHIELD-ON固定交联

时间：10分钟准备+24小时孵育

4. 设定烘箱温度至37°C。

5. 37°C预热SHIELD-ON溶液。

6. 去除SHIELD-Epoxy-OFF溶液。

7. 加入1.5 mL SHIELD-ON溶液。

8. 37°C 烘箱孵育24小时（可选：轻柔旋转）。

第4天：脱脂

时间：3.5小时+脱脂过夜

9. 去除 SHIELD-ON 溶液。

10. 室温摇床用1 mL 1× PBS 洗涤类器官3小时，每30分钟换一次PBS。

11.（可选）如果不使用LifeCanvas的商品化去脂液，可自制SDS去脂缓冲液：配方：200 mM SDS，10 mM 硼酸钠，100 mM 亚硫酸钠，pH 9.0。制备100 mL的方法：在玻璃瓶中加入100 mL去离子水（瓶上做液位标记）。倒出一半（约50 mL），剩下的水用于溶解。加热至50-55°C，搅拌下依次加入：5.77 g SDS（MW 288.38）、0.38 g 硼酸钠（MW 381.37）、1.26 g 亚硫酸钠（MW 126.04）。待SDS完全溶解后，降低温度至30°C，再加入硼酸钠和亚硫酸钠。用去离子水补回至100 mL液位。用5 M NaOH逐滴调整pH至9.0。剩余的SDS去脂缓冲液可在室温储存。

12. 去除 PBS 后，加入 1 mL 脱脂缓冲液（或SDS去脂缓冲液）。

13. 55°C过夜孵育（可选：使用轻柔的振荡器或旋转器）。脱脂过程可能需要6小时到48小时，具体取决于样本大小和成分。类脑类器官建议48小时脱脂。皮肤或IEO类器官可仅需12-18小时。

第5天：一抗孵育

时间：6.5小时 + 一抗孵育过夜

14. 小心地从含有类器官的管中取出脱脂缓冲液（或SDS去脂缓冲液）。

15. 0.1% PBS-T洗涤（6小时，前3小时每小时换液一次）。

16. 配制一抗溶液：按推荐浓度，常用浓度为10 μg/mL。总体积通常为100–500 μL，视样品大小而定。配制公式：C1V1= C2V2

17. 去除 PBS-T

18. 加入100-500 μL一抗溶液。

19. 室温摇床轻柔孵育过夜。

▲ 注意，如果抗体溶液体积较少（

第6天：二抗孵育

时间：4.5小时+二抗孵育过夜

20. 移除一抗。

21. PBS-T 洗涤4小时，每小时换液一次。

22. 配制二抗溶液： 按推荐浓度，一般为10 μg/mL，1 mL每管。

23. 去除PBS-T。

24. 加入二抗溶液，1 mL每管。

25. 室温避光孵育过夜。

第7天：折射率匹配（透明化）

时间：7.5小时+Easy-Index孵育过夜

26. 移除二抗

27. PBS-T洗涤4小时，每小时换液一次。

28. 准备50%浓度Easy-Index溶液：按 1:1 比例混合1× PBS和Easy-Index原液。可从低浓度逐步递增，避免样品塌陷。

29. 去除PBS-T后，加入1 mL 50%浓度Easy-Index溶液。

30. 37°C孵育3小时。

31. 去除50%浓度Easy-Index溶液。

32. 换为1-1.5 mL 100% Easy-Index原液，缓慢沿管壁加入（避免扰动）。若前期浓度较低，可逐步过渡。

33. 将管口密封（如用石蜡膜封住）.

34. 37°C摇床孵育过夜。

第8天：装片与成像准备

时间：30分钟

35. 准备双面硅胶垫，按照样本大小裁剪。

36. 将硅胶垫一面贴在载玻片上，轻压使其固定。

37. 去除硅胶垫另一面的保护膜。

38. 使用剪开的p1000吸头移取类器官，置于硅胶垫孔洞中。

39. 用100% Easy-Index补满孔洞，使液面略高于硅胶垫。

40. 盖上另一个盖玻片，从一侧缓慢放下，如有气泡，可轻轻抬起一角补充液体。

41. 在垫圈一侧用透明指甲油封边。

42. 完全干燥后重复另一侧。样品可双面在共聚焦显微镜（如Nikon Ti2、A1R）下成像。可选择大范围tile扫描与深层z-stack成像，以观察内部结构。

43. 将样品在4°C、避光条件下存放于Easy-Index溶液中。Koehler实验室数据显示：染色信号可至少稳定保存2个月甚至超过2年

（B）活体类器官振动切片

时长：2小时

▲ 所有涉及活体类器官组织的操作步骤均需在冰上进行。操作前，请确保所有材料和器械均已准备好。

1. 振动切片机准备：校准并准备振动切片机（Leica），按照说明书操作，包括使用Vibro-Check进行校准。切片过程中，确保振动切片机处于冰冷状态。

2. 制备包埋用低熔点琼脂糖（LMPA，2%）：在耐热Schott玻璃瓶中加入4 g LMPA粉末和100 mL双蒸水，放入磁力搅拌子。

3. 加热溶解LMPA：使用微波炉，每次加热10–15秒，期间反复摇晃，直至粉末完全溶解并略微沸腾。

▲ 注意：溶解后的LMPA非常烫，操作时注意防止烫伤。

4. 将玻璃瓶放在设定温度为41°C的加热磁力搅拌器上，以75 rpm搅拌，保持LMPA液态。

5. LMPA冷却至41°C时，从培养箱中取出类器官。放入2 mL圆底离心管，在1×DPBS中清洗三次。

6. 使用剪开的Wide-O p1000移液器吸头，将类器官转移至冷冻包埋模具（cryomold）中。

7. 使用p200移液器或配有钝头针的注射器，轻柔吸除多余的DPBS。

8. 将冷却至41°C的LMPA缓慢倒入模具，完全覆盖类器官。如有需要，使用无菌木棒或移液器吸头轻轻调整组织位置。

9. 将含有类器官的模具水平放置在冰上，让LMPA凝固，防止组织移动。

10. 在12孔板中加入冰冷的1×DPBS，备用用于收集切片。

11. LMPA完全凝固后（呈现微蓝色和浑浊状态），将其从模具中取出。用Kimwipe轻轻吸去多余水分。

12. 在金属托盘的支架上滴加少量瞬间胶。将LMPA块倒置粘贴到支架上，使类器官朝上。等待胶水完全固化。

13. 将装有LMPA块的金属托盘放入振动切片机的切片槽中，调整LMPA块前缘与蓝宝石切片刀片平行。

14. 向金属托盘中加入冰冷的无菌1×DPBS，液面高度刚好覆盖LMPA块顶面。外槽中加入冰块以维持低温。

15. 缓慢下降蓝宝石刀片，直至接近DPBS表面。

16. 调整刀片的起始（前）和结束（后）位置。

17. 将刀片抬起后继续缓慢下降，直至轻触DPBS表面。

18. 切片速度设为4，频率设为4。切片厚度200-250 μm。提示： 若切片过程中组织容易从LMPA中脱落，可以将LMPA浓度提高至4%。

19. 使用大而平的金属勺轻轻捞取漂浮的切片，放入之前准备好的装有冰冷1×DPBS的12孔板中。

20. 根据需要添加冰块，继续收集所有切片。

21. 将12孔板转移至生物安全柜内操作。

22. 在100 mm培养皿中预热OMM培养基。

23. 将组织切片转移到预热的OMM中。

24. 使用无菌镊子，轻柔地从LMPA中剥离组织切片。

25. 将去除LMPA的组织切片转移到含有OMM的12孔细胞培养板或玻底板中，进行恢复培养、短期培养或后续实验（如成像）。

26.（可选，建议用于长期培养）为防止组织重新聚球，可使用Minutien针（固定于滴有Sylgard的18 mm圆形盖玻片上）将切片固定。然后将其转移至新的无菌6孔或12孔板中进行长期培养。

27. 将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，按实验设计继续下游实验。

（C）固定类器官振动切片方案

时间：约2小时

▲ 使用已在4% PFA中固定过夜，或固定后储存在4°C、1×DPBS中的类器官。固定组织无需使用冰冷的DPBS，室温DPBS即可。

1. 与活体切片相同，按照厂家说明校准和准备振动切片机。固定组织应使用专用于固定样本的振动切片机。

2. 按照步骤96B的第(ii)至(xviii)步进行LMPA包埋与切片，但不包括步骤96B(v)的活体DPBS清洗。切片厚度调整为120-150 μm。

3. 当组织切片从LMPA中漂浮出来时，使用大而平的金属勺收集，放入装有1×DPBS的100 mm培养皿中。

4. 使用无菌镊子小心地从琼脂糖中剥离组织。

5. 将剥离好的切片转移到装有1×DPBS的12孔玻底板中，用于整体免疫染色或成像。随后按照步骤141A（单细胞捕获）和步骤141B（样本制备、冷冻包埋、冷冻切片与免疫染色）进行进一步处理。

预期结果

表1列出了评估IEO分化效率的关键检查点及各阶段的预期结果。

表1

若实验操作准确，IEO将按照特定的发育阶段逐步分化，可通过倒置显微镜观察到（图2-4）。在分化的第0至第3天，细胞团表面出现上皮结构，表明类器官开始响应Matrigel中细胞外基质（整合素和层粘连蛋白）及培养基中的形态发生因子信号，进入初步分化阶段（图2）。

若在第0天使用针对具体细胞系和BMP4供应商优化的BMP4浓度，该表面上皮将在第3天发育为表皮外胚层，并在bFGF和LDN的作用下，于第6至第8天进一步分化为感觉板外胚层（图3）。

随后，在第10至第12天，细胞团会形成突起的耳板（otic placode），并在第18天发育出囊泡状结构，可在明场或相差显微镜下观察到（图3）。

图3

到第21天，类器官应具备明显的耳泡形态特征，包括一个清晰的上皮层和内部腔隙（图4）。

图4

在第25至35天之间，类器官开始形成类似于天然前庭器官的感觉斑块。

到第36天，通过PCP4、POU4F3和MYO7A等特异性标记物即可识别出毛细胞前体（图5a）。这些感觉斑块周围被一层OTOR阳性的围耳间充质细胞包裹（图5b）。感觉斑块随后进一步分化为具备纤毛束的成熟毛细胞，大约在第50天，通过荧光鬼笔环肽染色可检测到纤毛束的存在（图5f）。与此同时，也会出现SOX2阳性的支持细胞，它们有助于感觉上皮的结构稳定（图5a）。

随着TUBB3阳性神经网络逐步向毛细胞形成复杂的神经支配（图5f,g和图6），可通过突触标记物免疫染色以及电镜观察确认毛细胞与神经元之间的突触连接。

在第50至110天期间，类器官持续成熟，毛细胞和支持细胞的数量及结构复杂度不断增加。功能检测（如电生理记录）表明，毛细胞开始展现功能性。

到第75天，类器官的整体结构和细胞组成基本接近人类妊娠中期（第二孕期）内耳的状态，包括清晰的前庭感觉上皮及相关支持结构（图4d和图5a,e）。尽管具体发育时间可能因细胞系略有差异，该标准化分化流程通常能在超过80%的IEO中获得理想的形态和功能。

图5

图6

但超过第100天后，类器官可能开始出现过度生长或结构紊乱，例如某些细胞类型的异常增殖，导致感觉上皮区域变得难以识别。因此，建议在大约第150天前完成相关下游实验，以保证类器官的最佳质量和实验相关性。

总体而言，该IEO模型为研究人类内耳发育、听觉和平衡障碍机制及潜在治疗策略提供了一个强有力的实验平台。

实验仪器和材料

生物材料

PS细胞系

对于本方案中呈现的数据，hiPSC和hESC来自市售和知名机构，例如Coriell研究所、Allen细胞科学研究所和WiCell研究所。hiPSC也由当地核心机构生成，例如波士顿儿童医院的F.M. Kirby人类神经元核心和莱顿大学医学中心的莱顿hiPSC中心，使用重编程的供体组织。已验证可用于生成IEO的细胞系包括但不限于：

• The WA25 hES cell line (WiCell Research Institute) NIHhESC-12-0196

• The WA01 hES cell line (WiCell Research Institute) NIHhESC-10-0043

• The mND2-0 hiPS cell line (WiCell Research Institute)

• The WTC-11 hiPS cell line (Allen Institute for Cell Science) and several fluorescently tagged hiPS cell lines developed from this parental line (notably, WTC11-mEGFP-SOX2-cl26)

• The LUMC0004iCTRL10 cell line (Leiden University Medical Center)

• The LUMC0099iCTRL04 cell line (Leiden University Medical Center)

• The LUMC0044iCTRL44 cell line (Leiden University Medical Center)

• The GON0515-03, GON0926-02 and SAH0047-02 cell lines (Boston Children’s Hospital)

▲ 注意：您研究中使用的细胞系应定期检查，以确保其正确且未感染支原体。我们建议在整个细胞培养过程中，大约每3-4个月进行一次支原体检测（Invivogen，产品目录号：rep-mys-10）。此外，建议对iPS细胞系进行核型分析，以确保原始细胞库和反复传代后的基因组稳定性。

试剂

细胞培养基和补充剂

• E8 Flex medium (Gibco, cat. no. A2858501)

• E6 medium (Gibco, cat. no. A1516401)

• mTeSR+ medium (STEMCELL Technologies, cat. no. 100-0276)

• Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)/F12 (Gibco, cat. no. 12634010)

• Neurobasal medium (Gibco, cat. no. 21103049)

• GlutaMAX supplement (Gibco, cat. no. 35050061)

• B-27 supplement, minus vitamin A (Gibco, cat. no. 12587010)

• N2 supplement (Gibco, cat. no. 17502048)

• 2-Mercaptoethanol (Gibco, cat. no. 21985023)

▲ 注意：2-Mercaptoethanol有毒，可能刺激呼吸道和皮肤。请佩戴合适的个人防护装备，并在生物安全柜内操作，避免接触皮肤。

• Normocin (InvivoGen, cat. no. ant-nr-1)

细胞解离和计数试剂

• 0.5 M ethylenediaminetetraacetic acid (Invitrogen, cat. no. 15575020)

• Accutase (Gibco, cat. no. A1110501)

• Trypan blue solution (Gibco, cat. no. 15-250-061)

小分子、蛋白质和基质

• Vitronectin (Gibco, cat. no. A14700)

• SB431542 in solution (SB; Stemgent, cat. no. 04-0010-05)

▲ 严重光敏感。请按照制造商建议，在−20°C 避光保存。

• Recombinant human bFGF (PeproTech, cat. no. 100-18B)

• Recombinant human BMP4 (PeproTech, cat. no. 120-05 and R&D Systems, cat. no. 314-BP; STEMCELL Technologies, cat. no. 78211 是另一种选择——请参阅SKO方案，Lee 等人，2022 年）.

▲ BMP4的活性可能因供应商、批次和实验室操作而异。为确保最佳活性，请遵循供应商数据表中推荐的复溶说明。使用新的供应商、批次或复溶瓶时，应根据效价差异对BMP4治疗方案进行调整。为了在实验中获得一致的结果，请尽可能使用相同批次的BMP4。

• LDN-193189 in solution (LDN; Stemgent, cat. no. 04-0074-02)

▲ 严重光敏感。请按照制造商建议，在−20°C避光保存。

• CHIR in solution (Stemgent cat. no. 04-0004-02)

• Y27632 in solution (Y; Stemgent, cat. no. 04-0012-02)

• Matrigel, growth factor reduced (Corning, cat. no. 356231)

样本固定和冷冻包埋试剂

• 16% paraformaldehyde solution (PFA; Electron Microscopy Sciences, cat. no. 15710)

▲ 注意PFA是一种潜在的致癌物，应始终在通风橱中使用。

• Sucrose (MP Biomedicals, cat. no. ICN19401891)

• Tissue freezing medium kit (Triangle Biomedical Sciences, cat. no. 15-183-36)

• Tissue Plus OCT compound (Fisher Scientific, cat. no. 23-730-571)

活体和固定振动切片试剂

• Low melting point agarose (LMPA; Thermo Scientific, cat. no. 16520050)

• Hanks’ balanced salt solution with calcium and magnesium (Gibco, cat. no. 14025092)

• Superglue (WB Mason, cat. no. GOR7805003)

• Sylgard (Fisher Scientific, cat. no. NC0162601)

免疫染色和整体染色试剂

• Normal goat serum (Vector Laboratories, cat. no. s-1000-20)

• Normal horse serum (Vector Laboratories, cat. no. s-2000-20)

• Prolong Gold antifade mountant (Invitrogen, cat. no. P369304)

• DAPI (Invitrogen, cat. no. D3571)

▲ 注意 DAPI 具有潜在的致突变性和/或致癌性，应小心处理。

• Hoechst (Invitrogen, cat. no. H3570)

▲ 注意 DAPI 具有潜在的致突变性和/或致癌性，应小心处理。

• SHIELD Kit (contains: SH–SH–ON, epoxy, SH-Buffer and SH–ON) (Life Canvas Technologies, cat. no. SH-500)

▲ 注意：SHIELD套件中的一些组件具有毒性，应按照供应商的规定使用。

▲ 其中一种成分12.5% SHIELD-Epoxy-OFF 可以在4°C下保存长达 2 周。

• Sodium dodecyl sulfate (SDS; Millipore Sigma, cat no. L3771)

• Sodium borate (Millipore Sigma, cat no. 933953)

▲ Sodium borate具有潜在的致突变性和/或致癌性，应小心处理。

• Sodium sulfite (Millipore Sigma, cat no. 239321)

• 5 M NaOH (Millipore Sigma, cat no. S8263)

▲ 注意NaOH具有腐蚀性，应小心处理并安全储存。

缓冲液和其他试剂

• 1× phosphate-buffered saline (pH 7.4) (PBS; Gibco, cat. no. 10010049)

• 1× Dulbecco’s PBS (DPBS; Gibco, cat. no. 14190250)

• 10% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, cat. no. 93443)

• Dimethyl sulfoxide (DMSO; Fisher BioReagents, cat. no. BP231-100)

• 1 M Tris–HCl, pH 7.5 (Fisher BioReagents, cat. no. BP1757-100)

▲ 要从PeproTech重构人重组bFGF，请检查冻干粉提供的数据表和分析证书以获取正确的重构说明。

• Citric acid (Fisher Chemical, cat. no. A104-500)

▲ 从 PeproTech 重构人类重组BMP4，请检查冻干粉提供的数据表和分析证书以获取正确的重构说明。

• Hydrochloric acid (HCl; Thermo Fisher Scientific, cat. no. A144S-500)

▲ 了解 R&D Systems 重组人 BMP4 的重构方法，请查看冻干粉附带的数据表和分析证书，了解正确的重构说明。

• Human serum albumin (HSA; Sigma-Aldrich, cat. no. A9731)

▲ 作为重组蛋白重建的载体蛋白，HSA对于重组蛋白的稳定性和功效至关重要。

免疫染色所需抗体

一抗：

二抗：

器材设备

用于细胞培养

• STERILGARD 404 E3 (biosafety cabinet; Baker, cat no. SG404) • MCO-170AICUVL-PA CellIQ (incubator; PHC Corporation of North America, cat no. MCO-170AICUVL-PA)

• CO2-resistant shaker (Thermo Scientific, cat. no. 88881101)

• Universal aluminum platform for CO2-resistant shaker (Thermo Scientific, cat. no. 88-881-122)

• Six-well culture plates (Corning, cat. nos. 353046, 3516 or Thermo Scientific, cat. no. 140675)

• U-bottom low-attachment 96-well plates (Thermo Scientific, cat. no. 174925 or S-Bio, cat. no. MS-9096UZ)

▲ 不同供应商使用的不同涂层材料会影响分化的效率和质量。

• Low-attachment 24-well plates (Thermo Scientific, cat. no. 174930)

▲ 同供应商使用的不同涂层材料会影响分化的效率和质量。

• Invitrogen Countess III FL automated counter (Invitrogen, cat. no. AMQAF2000)

• Disposable cell counting chamber slides for Countess automated cell counter (Invitrogen, cat. no. C10228).

• 10 mL reagent reservoirs (VistaLab Technologies, cat. no. 21-381-093)

• 25 mL reagent reservoirs (VistaLab Technologies, cat. no. 21-381-27D)

• 5 mL round-bottom polystyrene test tubes with cell strainer snap caps (mesh size 35 μm) (Corning, cat. no. 352235)

• 250 μL wide-orifice (Wide-O) LiteTouch System (LTS) pipette tips, low retention, sterile (Rainin, cat. no. 30389250)

• 1,000 μL Wide-O LTS pipette tips, low retention, sterile (Rainin, cat. no. 30389221) • 100 mm bacteriological Petri dishes with lid (Falcon, cat. no. 351029)

• 2 mL Corning externally threaded cryogenic vials (Corning, cat. no. 430659)

• Corning CoolCell FTS30 cell freezing vial containers (Corning, cat. no. 432008)

• Corning CoolCell LX cell freezing vial containers (Corning, cat. no. 432002)

用于试剂准备

• pH meter (Mettler Toledo, cat. nos. 01-915-102, 01-917-142)

• Stirrer with ceramic plate, Isotemp 30 °C to 540 °C (Fisher Scientific, cat. no. FB30786163)

• Parafilm (Bemis, cat. no. PM996)

• Hamilton fume hood (Fisher Hamilton L.L.C., cat. no. 70864)

• 0.22 μm filter (Millipore Sigma, cat. no. SLGPR33RS)

• BD Slip tip 1 mL sterile syringes (Fisher Scientific, cat. no. 14-823-434)

▲ 用于在重组蛋白重建过程中过滤HSA溶液。

用于冷冻切片和免疫染色

• Cryostat (Leica, cat. no. 149491860us)

• Tissue-Tek biopsy cryomolds 10 mm × 10 mm × 5 mm (Sakura Finetek, cat. no. 4565)

• Tissue-Tek intermediate cryomolds 15 mm × 15 mm × 5 mm (Sakura Finetek, cat. no. 4566)

• Desiccator (Thermo Scientific, cat. no. 53110250)

• Superfrost Plus slides (Fisher Scientific, cat. no. 12-550-15)

• 24 mm × 50 mm #1 Thickness Cover Glass (Fisher Scientific, cat. no. 22-050-233)

• PAP pen (Electron Microscopy Sciences, cat. no. 71310)

• Coplin jar (IHC World LLC, cat. no. IW2501C)

• Humidified slide staining chamber (Fisher Scientific, cat. no. NC9062083)

• 3D platform rotator (Fisher Scientific, cat. no. 88-861-045)

• Eight-well silicone isolators 2.0 mm (Electron Microscopy Sciences, cat. no. 70339-44)

• Eight-well silicone isolators 2.5 mm (Electron Microscopy Sciences, cat. no. 70339-46)

• 12-well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass (Cellvis, cat no. P12-1.5H-N)

• 24-well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass (Cellvis, cat no. P24-1.5H-N)

• 96-well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass (Cellvis, cat no. P96-1.5H-N)

• 35 mm Petri dish with 14 mm diameter glass bottom microwell (MatTek, cat. no. P35G-1.5-14-C)

用于震动切片

• Leica vibratome VT1000S and Leica vibratome VT1200 (Leica Microsystems, cat. no. 140 4723 5612 and 140 4814 2065)

▲ 建议对固定组织和活组织使用单独的振动切片机，以避免交叉污染和活组织的意外固定。

• Disposable base molds (Fisher Scientific, cat. no. 22-363-553)

• Disposable transfer pipette (Thermo Scientific, cat. no. S304673)

• Vibratome sapphire blade (Delaware Diamond Knives, cat. no. SAFN)

• Minutien pins (Fine Science Tools, cat. no. 26002-10)

• 18 mm round coverslips (Thomas Scientific, cat. no. 1217N81)

• 12-well culture plate (Thermo Fisher Scientific, cat. no. 150628)

• 12-well glass-bottom plate (Cellvis, cat. no. P12-1.5H-N)

• Perforated metal spoon, diameter 20 mm (World Precision Instruments, cat. no. 501997)

用于成像和图像分析

• Nikon Ts2R (Nikon Instruments, cat. no. MFA34200)

• Nikon Ti2 (Nikon Instruments, cat. no. MEA54000)

• Nikon A1R (Nikon Instruments, cat. no. A1R-HD25 4-line Package)

• NIS-Elements Imaging Software (Nikon Instruments, cat. no. MQS31100)

• ImageJ

常规仪器

• Moria perforated spoon, diameter 15 mm (Fine Science Tools, cat. no. 1037018)

• Moria perforated spoon, diameter 20 mm (Fine Science Tools, cat. no. 10370-17)

• Kimwipes (Kimtech Science, cat. no. 34256) • 0.6 mL snap cap low-retention microcentrifuge tubes (Thermo Scientific, cat. no. 3446)

• 1.5 mL snap cap low retention graduated microcentrifuge tubes (Thermo Scientific, cat. no. 3448)

• 2 mL round-bottom microcentrifuge tubes with locking snap cap (Fisher Scientific, cat. no. 14-666-315)

• 15 mL conical tubes (Thermo Scientific, cat. no. 12-565-268)

• 50 mL conical tubes (Thermo Scientific, cat. no. 12-565-270)

• 5 mL serological pipettes (Fisherbrand, cat. no. 13-678-11D)

• 10 mL serological pipettes (Fisherbrand, cat. no. 13-678-11E)

• 25 mL serological pipettes (Fisherbrand, cat. no. 13-678-11)

• 50 mL serological pipettes (Fisherbrand, cat. no. 13-678-11F)

• Starter kit including four LTS Pipet-Lite XLS+ manual single channel pipettes (Rainin, cat. no. 30386597)

• 20 μL LTS pipette tips, low retention, sterile (Rainin, cat. no. 30389229)

• 250 μL LTS pipette tips, low retention, sterile (Rainin, cat. no. 30389246)

• 250 μL LTS pipette tips, wide orifice, low retention, sterile (Rainin, cat. no. 30389250)

• 1,000 μL LTS pipette tips, low retention, sterile (Rainin cat. no. 30389216)

• 1,000 μL LTS pipette tips, wide orifice, low retention, sterile (Rainin cat. no. 30389221)

局限性

首先，IEO来源于干细胞，其成熟度和功能尚不完全。虽然它们可以模拟人类内耳前庭器官的多个关键特征，但仍无法完全重现真实内耳的复杂结构，如充满液体的腔室、螺旋状的耳蜗或半规管的精细形态。

虽然IEO中的毛细胞具有极性，并能与下层间充质及内皮细胞形成突触连接，但类似真实内耳的结构细分（如中央区 vs. 周边区，或壶腹感受上皮）尚未在IEO中明确且稳定地复制。这限制了其用于深入研究内耳功能机制的能力。

未来，结合微流控系统（如PREDICT96或Emulate芯片）或Transwell装置，可能有助于改善对毛细胞顶端面的接触，从而实现目前较难完成的功能性检测。

此外，IEO在结构上仍较为简化，缺乏如耳石膜和盖膜等关键顶端结构，目前也尚不清楚其是否具备足够数量的特定细胞来调控囊腔液体的离子组成、形成类似成熟内淋巴的微环境。这些限制使IEO难以完全模拟内耳的各种疾病状态。

同一细胞系中不同批次之间的差异，影响实验结果的稳定性和重复性。这种差异可能来自多个因素，例如不同批次的BMP4活性略有不同、细胞传代次数、实验操作熟练程度等。

更重要的是，不同细胞系对BMP4的反应性本身就可能不同，我们推测这与细胞内源性BMP4的表达水平有关。因此，在使用新细胞系时，建议先进行BMP4浓度测试，以确定最适浓度，提高诱导效率和稳定性。

问题及解决

问题1：BMP4浓度梯度优化（第32步）

正如之前所述，BMP4的最佳工作浓度不仅依赖于细胞系本身——由于不同细胞系的内源性BMP4表达水平不同——还受到具体使用的BMP4试剂批次的影响。本实验中的建议浓度基于PeproTech公司的BMP4产品。

为了获得最佳分化效果，在使用新的细胞系时，建议首先进行BMP4浓度梯度测试。选择3–4个不同的BMP4浓度，并持续观察分化至第12天的培养效果，以评估分化效率。

举例说明：对于WA25 hES细胞，最佳BMP4浓度为0.5-0.75 ng/mL。对于WTC-11 hiPS细胞，最佳浓度稍高，为0.75-2.00 ng/mL。对于LUMC04i10和LUMC44i44细胞系，最佳浓度为 1.25 ng/mL。

综合来看，我们建议的通用BMP4浓度范围为 0.5-2.5 ng/mL，适用于大多数人类多能干细胞系。

问题2：Matrigel的正确使用（涉及步骤：31-32，70-72 和 83-84）

Matrigel是一种温度敏感的细胞外基质，来源于小鼠肉瘤，能够支持细胞团块培养，促进结构化组织形成及细胞增殖。关键注意事项：Matrigel在高于16°C时会开始凝胶化。必须始终冷冻保存，使用前需要在冰上缓慢融化过夜。所有与Matrigel接触的培养基、移液枪头及实验耗材，必须事先在4°C预冷，以避免提前凝胶化，从而确保均匀分布。

常见错误：如果Matrigel在培养基中的稀释不充分，在相差显微镜下会看到明显的团块，尤其是在细胞团周围。这种不均匀会导致细胞迁移到Matrigel较浓的区域，脱离原有的细胞团，影响分化效果。

正确操作建议：使用预冷的移液器吸头，将Matrigel轻柔而彻底地加入冰冷的培养基中。避免产生气泡。如果观察到分布不均，应立即重新混匀Matrigel与培养基的混合液。

参考文献

van der Valk, W. H., Nist-Lund, C., Zhang, J., Perea, C., Jin, J., Gim, K. Y., Steinhart, M. R., Lee, J., & Koehler, K. R. (2025). Generation and characterization of vestibular inner ear organoids from human pluripotent stem cells. Nature protocols, 10.1038/s41596-025-01191-3.